按照革蘭氏染色法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類，細(xì)菌大致可分為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌兩大類。其中，大多數(shù)化膿性球菌都屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，而大多數(shù)腸道菌都屬于革蘭氏陰性菌。
從分子結(jié)構(gòu)上區(qū)分，革蘭氏陰性菌具有不對(duì)稱的外膜，外膜上有脂多糖（LPS），可作為保護(hù)細(xì)胞免受化學(xué)應(yīng)激的分子篩，并且內(nèi)/外膜間有一層很薄的肽聚糖。
而革蘭氏陽(yáng)性菌只有一層對(duì)稱的磷脂膜，且有一層包裹細(xì)胞的肽聚糖，比革蘭氏陰性菌厚。
雖然現(xiàn)在熒光顯微技術(shù)、熒光原位雜交（FISH）等新技術(shù)被用于細(xì)菌分類，但是相對(duì)操作復(fù)雜且需要特定地方操作，不具有隨時(shí)檢測(cè)能力。
近日，新加坡國(guó)立大學(xué)的Guillermo C. Bazan和南洋理工大學(xué)的Jamie Hinks（共同通訊作者）等人聯(lián)合報(bào)道了通過(guò)使用鏈延長(zhǎng)的共軛低聚電解質(zhì)COE-S6，可以輕松對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏分類。具體而言，利用COE-S6作熒光膜探針，可以一步就區(qū)分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。通過(guò)共聚焦顯微成像、對(duì)含磷脂/脂多糖的模型膜的差示掃描量熱法表明，脂多糖會(huì)阻礙COE-S6膜嵌入革蘭氏陰性菌中。通過(guò)用非特異性和親脂性膜探針FM 4-64對(duì)COE-S6進(jìn)行復(fù)染色，可以對(duì)混合物中的兩種革蘭氏類型進(jìn)行離散標(biāo)記。因此，利用該單步操作過(guò)程可原位觀察復(fù)雜的微生物生物膜，從而進(jìn)行革蘭氏分類。在嵌入COE-S6后，革蘭氏陽(yáng)性菌的熒光強(qiáng)度顯著增加，用肉眼可以直接觀察。此外，COE-S6不會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，并且易于使用，是一種有前景的膜特異性熒光探針。
COE-S6特異性的革蘭氏標(biāo)記
在加入COE-S6前，作者用PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次收集的過(guò)夜生長(zhǎng)的平衡期培養(yǎng)物。作者收集了COE-S6在450-490 nm內(nèi)發(fā)射形成的熒光圖像。在相同染色條件下（[COE-S6]=2×10-6M），從銅綠假單胞菌檢測(cè)到的放射微不足道。原位觀察金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的混合培養(yǎng)物，進(jìn)一步證明COE-S6可以選擇性染色，其中僅有球菌形金黃色葡萄球菌突出COE-S6的發(fā)射。實(shí)驗(yàn)表明，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，COE-S6在金黃色葡萄球菌中的吸收率為65％，在銅綠假單胞菌中的吸收率為7％，說(shuō)明COE-S6可用作革蘭氏陽(yáng)性菌的選擇性原位標(biāo)記染料。
探究COE-S6特異性膜標(biāo)記的位置
作者將大腸桿菌O111：B4中的脂多糖（LPS）與大型多層囊泡（LMVs）在緩沖溶液中以8: 100的重量比混合，以生成脂多糖覆蓋的LMVs（LPS-LMVs），模擬革蘭氏陰性菌的外膜。用2×10-6M?COE-S6處理后，觀察到LMVs最外膜層的清晰熒光圖案。此外，共聚焦熒光顯微照片發(fā)現(xiàn)，COE-S6結(jié)合在最外層，沒(méi)有穿過(guò)內(nèi)囊泡層。在兩種類型中都觀察到了強(qiáng)度相似的顯著熒光信號(hào)。將LPS與磷脂（POPE和POPG）的重量比從0：100增加到20：100，進(jìn)一步驗(yàn)證LPS對(duì)COE-S6選擇性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，LPS的存在會(huì)阻礙COE-S6嵌入膜中。
結(jié)合使用COE-S6和FM 4-64復(fù)染
作者利用熒光顯微鏡成像同時(shí)可視化兩種革蘭氏細(xì)菌。將等體積的具有相同光密度的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌與PBS混合，并用COE-S6（2×10-6?M）處理15?min，再用FM 4-64（1×10-6?M）處理15 min。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，COE-S6存在金黃色葡萄球菌中。FM 4-64染色的兩種細(xì)菌，銅綠假單胞菌的發(fā)射強(qiáng)度更高。此外，作者還研究了大腸桿菌K12（革蘭氏陰性菌）。其中，帶有金黃色葡萄球菌的COE-S6和帶有大腸桿菌K12的FM 4-64都出現(xiàn)清晰的膜熒光，但是COE-S6無(wú)法滲透到大腸桿菌K12膜中。結(jié)果表明，COE-S6作為選擇性膜標(biāo)記染料在革蘭氏細(xì)菌分類中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
原位生物膜革蘭氏分類
作者將每種細(xì)菌以相同的接種密度接種到小孔蓋玻片中，并在37?oC下孵育，制備了由糞腸球菌OG1RF和大腸桿菌UTI89組成的生物膜。在檢查前，將所得的生物膜用PBS沖洗，在用4×10-6M?COE-S6和2×10-6M?FM 4-64的混合物染色15 min。其中，圖5顯示了COE-S6（綠色）和FM 4-64（紅色）的發(fā)射位置。糞腸球菌優(yōu)先被COE-S6染色，而大腸桿菌被FM 4-64染色。三維（3D）堆疊視圖揭示了糞腸球菌和大腸桿菌的空間分布。需注意，對(duì)比熒光蛋白標(biāo)記或核酸染色方法，清楚地觀察到內(nèi)部生物膜結(jié)構(gòu)，糞腸球菌形成短鏈，而大腸桿菌則分散為單個(gè)細(xì)胞。將COE-S6和FM 4-64結(jié)合使用，可監(jiān)控生命系統(tǒng)中的單個(gè)細(xì)胞類型，而不會(huì)損害細(xì)胞生存力或膜結(jié)構(gòu)。
COE-S6的光致發(fā)光（PL）光譜測(cè)量
最后，作者測(cè)量了COE-S6的PL強(qiáng)度，希望以此來(lái)確定革蘭氏類型。對(duì)比不存在細(xì)胞或存在銅綠假單胞菌，存在金黃色葡萄球菌時(shí)，COE-S6的PL強(qiáng)度更大。但是添加銅綠假單胞菌后，發(fā)射強(qiáng)度僅略有變化。此外，在365 nm紫外線燈下，作者記錄了未處理的對(duì)照、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌三組的熒光強(qiáng)度差異。發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌組的熒光最強(qiáng)，表明COE-S6標(biāo)記可用于肉眼檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
總之，作者提出了一種利用共軛低聚物COE-S6對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜染色的方法。利用COE-S6可通過(guò)常規(guī)熒光計(jì)測(cè)量增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度或肉眼直接觀察紫外光激發(fā)后的熒光，進(jìn)行區(qū)分革蘭氏菌的類型。該方法易操作、不需要任何固定或其他預(yù)處理要求，即可簡(jiǎn)單、快速地區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。
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