近年來,由疾病、外部創(chuàng)傷等原因引起的骨缺損一直是研究熱點和產(chǎn)業(yè)熱點。上市的產(chǎn)品不勝枚舉，在功能上也是各有千秋。所以想在如此成熟的領(lǐng)域再有所斬獲，推陳出新，甚至將其發(fā)表在《Nature?Materials》，難度可見一斑。
骨缺損處需要大量的填充物。根據(jù)經(jīng)典的組織工程三要素理論設(shè)計的填充支架存在一個重大挑戰(zhàn)就是種子細(xì)胞植入體內(nèi)后存活率低，這嚴(yán)重影響了其修復(fù)再生的能力。那能不能給細(xì)胞打打雞血？安心骨修復(fù)呢？
倫敦國王學(xué)院干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)中心的研究團隊近日報道了一種新型骨修復(fù)繃帶，以生物可降解的聚己內(nèi)酯(PCL)作為繃帶基材，通過調(diào)控Wnt信號通路，實現(xiàn)人骨骼干細(xì)胞（hSSCs）長期（＞8周）存活能力。在大鼠顱骨缺損模型中，經(jīng)修復(fù)后的新形成的骨在結(jié)構(gòu)上可與成熟的皮質(zhì)骨相媲美，并由人（人的細(xì)胞由修復(fù)繃帶負(fù)載植入的）和鼠細(xì)胞組成。該研究精巧地在修復(fù)繃帶上設(shè)計了一種包含三維Wnt誘導(dǎo)成骨組織模型(WIOTM)，介導(dǎo)人骨骼干細(xì)胞不對稱分裂，同時產(chǎn)生Wnt-近端骨骼肌干細(xì)胞和易于分化的Wnt-遠(yuǎn)端細(xì)胞，促進骨修復(fù)。
Wnt3a誘導(dǎo)細(xì)胞不對稱分裂，成骨基因差異化表達(dá)
根據(jù)作者前期研究，發(fā)現(xiàn)在Wnt3a蛋白的刺激下，大約53%的骨骼肌干細(xì)胞激活了Wnt?/β連環(huán)蛋白通路（Wnt/β-Catenin通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性，并且在發(fā)育過程中決定細(xì)胞的分化命運）。有意思的是，與固定化的Wnt3a不同，在可溶性的培養(yǎng)基中加入Wnt3a蛋白可誘導(dǎo)hSSC增殖，但是不促進細(xì)胞遷移。研究人員進而探究，細(xì)胞的分裂方向與多層形成是否由Wnt3a在hSSCs一側(cè)的不對稱呈現(xiàn)耦合和調(diào)控的（圖2b，Wnt3a表面上可能的細(xì)胞分裂模式的三維圖示）。研究人員在Wnt3a平臺上低密度培養(yǎng)hSSCs，并在成骨培養(yǎng)基中加入COL1-gel，利用三維成像顯示了hSSCs中期有絲分裂的方向，發(fā)現(xiàn)存在兩類分裂方式的細(xì)胞。其一，垂直于Wnt3a平臺且在花狀染色質(zhì)環(huán)的中期排列染色體的細(xì)胞（圖1 d, e）；其二，平行于Wnt3a平臺分裂的細(xì)胞，其染色質(zhì)環(huán)立在邊緣，從上面看是一個長方形。與此同時，與未被激活Wnt/β-Catenin通路的細(xì)胞相比，作者觀察到垂直于Wnt3a平臺分裂的細(xì)胞比例顯著增加（圖1c）。除了分裂方式不同，在垂直于Wnt3a -平臺的分裂中，作者發(fā)現(xiàn)腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白APC、極性蛋白非典型激酶Cζ（紡錘體定向通常需要將極性蛋白不典型蛋白激酶Cζ(aPKCζ)劃分到細(xì)胞的一側(cè)）和連環(huán)蛋白catenin主要定位于Wnt3a -近端細(xì)胞(圖1d-g,l)。在平行分裂中，這些蛋白在細(xì)胞的兩半中分布相似 (圖. 1d,g,l)。
在相關(guān)基因表達(dá)上，最近發(fā)現(xiàn)的hSSC標(biāo)記物CDH13和PLXNA2在Wnt3a -近端細(xì)胞中高表達(dá)，在遠(yuǎn)離Wnt3a -平臺的細(xì)胞中下調(diào)（圖2 a,b,c）。然而成骨基因OCN和OPN在Wnt3a -遠(yuǎn)端細(xì)胞中高表達(dá)（圖2 d,f）。在平行于wnt3a平臺分裂的細(xì)胞中，分裂的細(xì)胞對之間的干細(xì)胞和分化標(biāo)志物分布是一致的（圖2e,f,i–k）。
因此作者認(rèn)為，在以Wnt3a介導(dǎo)的單個hSSCs分裂過程中，定位的Wnt3a誘導(dǎo)Wnt3a近端-細(xì)胞中干細(xì)胞命運標(biāo)記物的富集，誘導(dǎo)Wnt3a-遠(yuǎn)端細(xì)胞的早期成骨分化標(biāo)志物富集。
圖1所示。定位的Wnt3a誘導(dǎo)骨骼干細(xì)胞不對稱分裂。
圖2所示。定位的Wnt3a誘導(dǎo)細(xì)胞命運標(biāo)記物在分裂細(xì)胞中不對稱分布。
生物降解Wnt3a繃帶的制作，驗證骨修復(fù)能力
為了將誘導(dǎo)成骨模型（WIOTM，Wnt3a誘導(dǎo)骨骼干細(xì)胞所形成的成骨模型）移植到體內(nèi)，研究人員設(shè)計了一種結(jié)合Wnt3a蛋白生物相容性繃帶，用于移植移植細(xì)胞。他們使用臨床認(rèn)可的聚己內(nèi)酯(PCL)聚合物薄膜，經(jīng)過氧等離子體處理表面，然后用氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)孵育)。?(O2/APTES)為Wnt3a共軛提供了伯胺官能團。重要的是，支架上的伯胺官能團在室溫下可保持8周穩(wěn)定性。純化的Wnt3a蛋白通過戊二醛共價結(jié)合到胺基上。
研究人員制備出骨修復(fù)繃帶后，首先用western blot分析驗證了Wnt3a成功地共價結(jié)合到了PCL繃帶上(圖3 a)。同時為了驗證結(jié)合后的Wnt3a活性，作者又進行了TCF-熒光素酶報告細(xì)胞系(LS/L)測定（TCF是β-catenin通路激活的一個標(biāo)志性效應(yīng)因子），顯示共價結(jié)合后的Wnt3a保持了極高的激活β連環(huán)蛋白途徑的能力(圖3 b)。為了驗證hSSCs的活性，作者將具有7xTCF-eGFP//SV40-mCherry基因的hSSCs種植在了Wnt3a繃帶上，結(jié)果顯示，接枝了20或60 ng Wnt3a的Wnt3a-PCL的hSSCs顯示eGFP表達(dá)的增強呈劑量依賴性，而iWnt3a-PCL和牛血清白蛋白-PCL (BSA-PCL)對照顯示eGFP的基礎(chǔ)水平表達(dá)(圖3c,d)。eGFP表達(dá)受7xTCF結(jié)合位點控制，mCherry顯示紅色熒光，在細(xì)胞中是組成性共表達(dá)。
圖3。Wnt3a -繃帶的體外功能研究
研究人員以大鼠顱骨缺損為模型，驗證繃帶的體內(nèi)修復(fù)的效果。植入修復(fù)八周后，微型計算機斷層掃描(μCT)分析結(jié)果顯示，由Wnt3a繃帶覆蓋的缺損部位表現(xiàn)出明顯的新骨形成，而WIOTM繃帶組表現(xiàn)出更多的骨形成，為Wnt3a繃帶組的近兩倍(圖 4c,d)。組織學(xué)染色評價表明，WIOTM繃帶組的缺損部位新形成的骨礦化區(qū)域顯示了健康骨的組織學(xué)特征，其中核被拉長且稀疏分布，此外，周圍的鈣化組織呈現(xiàn)條紋，這是板層骨的特征(圖4e,f)。連接缺損的結(jié)締組織/間質(zhì)樣組織顯示出密集的細(xì)胞核(圖4e)。在Wnt3a和WIOTM繃帶組處理的缺損中，缺損部位中段和缺損邊緣均有新骨形成，表明在修復(fù)和再生過程中，新骨與已有骨融合(圖4e)。新形成的骨內(nèi)血管也被檢測到(圖4f)。
圖4。Wnt3a和WIOTM繃帶在修復(fù)骨缺損中的體內(nèi)功能評價。
小結(jié)
最后，研究者得出結(jié)論，接枝了Wnt3a的修復(fù)繃帶打破了細(xì)胞分裂過程的對稱性，使hSSCs分裂形成富集早期成骨分化基因的Wnt3a -遠(yuǎn)端細(xì)胞和富集了連環(huán)蛋白、APC、細(xì)胞極性蛋白aPKC和干細(xì)胞標(biāo)記物的Wnt3a -近端細(xì)胞。該種設(shè)計，即WIOTM繃帶，能同時維持損傷部位的人的hSSCs和成骨細(xì)胞，加速骨修復(fù)。植入體內(nèi)后顯示出了極佳的骨修復(fù)效果。
該研究成果以題為“Wnt-modified materials mediate asymmetric stem cell division to direct human osteogenic tissue formation for bone repair”的論文發(fā)表在《Nature Materials》上（見文后原文鏈接）。文章第一作者為Yoshihisa Okuchi，通訊作者為倫敦國王學(xué)院干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)中心的 Shukry J. Habib教授。
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