如何快速地3D打印具有細(xì)胞尺寸孔徑的生物支架？現(xiàn)有的生物墨水打印成型后大多會形成納米尺寸孔徑，遠(yuǎn)小于細(xì)胞的大小，因此往往會阻礙細(xì)胞在生物支架內(nèi)的伸展、遷移、代謝、以及營養(yǎng)物質(zhì)的輸運(yùn)。另外，有研究表明具有細(xì)胞大小孔徑的支架能促進(jìn)細(xì)胞的功能。因此3D打印具有細(xì)胞尺寸孔徑的生物支架，在細(xì)胞和組織工程領(lǐng)域具有重要意義。
現(xiàn)有擠出式生物打印技術(shù)在打印10微米級別的孔徑捉襟見肘(圖1)。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的成孔方法（比如凍干處理）沒法實(shí)現(xiàn)實(shí)時細(xì)胞打印，而且10微米級的結(jié)構(gòu)對3D打印精度和速度提出很大的挑戰(zhàn)。這個方向最近成為一個3D打印領(lǐng)域的熱點(diǎn)。新進(jìn)開發(fā)的多孔生物打印方法基于膠束或水相乳液，添加到生物墨水中打印形成多孔結(jié)構(gòu)。這些方法局限于生物墨水的穩(wěn)定性，導(dǎo)致可打印窗口有限，另外形成的多孔結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度較低，而且難以調(diào)解支架的力學(xué)性能（比如粘彈性）。這些問題限制了在生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用。
針對以上問題，加拿大麥吉爾大學(xué)李劍宇教授團(tuán)隊(duì)首次提出響應(yīng)微孔成型生物打印方法（Triggered?Micropore-Forming bioprinting），利用水凝膠刺激響應(yīng)的微分相行為實(shí)現(xiàn)新型生物支架的快速制造、力學(xué)性能的有效調(diào)控，并促進(jìn)細(xì)胞活性和功能。該新型生物打印方法可制造高度聯(lián)通且具有細(xì)胞大小孔徑的多孔水凝膠，并在低聚合物濃度的條件下首次實(shí)現(xiàn)彈性、粘彈性、孔隙三種特性正交調(diào)控。
該團(tuán)隊(duì)利用殼聚糖pH值從酸性到中性過程中發(fā)生微分相的特性來展示TMF打印方法。該生物墨水由負(fù)載細(xì)胞的殼聚糖（chitosan）和聚乙二醇（PEG）微酸性水溶液組成。其在室溫下打印到控制pH值的明膠嵌入式打印支撐物中后，通過溫度升高到37℃可融化明膠并提升生物墨水的pH值。Chitosan在pH提升到其pKa值（約6.5）之后會發(fā)生微分相行為并引發(fā)物理交聯(lián)形成多孔水凝膠。
研究發(fā)現(xiàn)該凝膠的彈性性能可通過嵌入式打印支撐物的pH值調(diào)節(jié)，其剪切模量（G’）范圍為0.5-27 kPa，橫跨三個數(shù)量級。若固定打印支撐物的pH而增加墨水中PEG的含量，凝膠的應(yīng)力松弛減半時間可從104秒調(diào)節(jié)到102秒，同時保持剪切模量不變。在孔徑的表征上，該團(tuán)隊(duì)使用了共聚焦顯微鏡和掃描電鏡兩種方式，同時驗(yàn)證了這一TMF方法可產(chǎn)生細(xì)胞大小孔徑，且孔高度聯(lián)通。這一研究首次實(shí)現(xiàn)了凝膠的彈性、粘彈性、孔隙三種特性的正交調(diào)節(jié)。該生物墨水系統(tǒng)具有良好的細(xì)胞兼容性，且在厚支架中保持較高的細(xì)胞存活率。細(xì)胞在多孔凝膠內(nèi)部的遷移速率也顯著高于非多孔標(biāo)準(zhǔn)凝膠。
該生物墨水在室溫下長期穩(wěn)定，同時具有良好的流變性能便于擠出式打印。通過改變打印速度和壓強(qiáng)，同一個30G針頭可在120-1500微米范圍內(nèi)調(diào)節(jié)線寬。通過不同生物墨水的組合，還可制造出具有粘彈性梯度的多孔凝膠。為了展現(xiàn)TMF打印方法和該生物墨水在生物工程上的應(yīng)用，研究人員首先打印了由人聲帶成纖維細(xì)胞和人氣管上皮細(xì)胞組成的復(fù)合聲帶結(jié)構(gòu)。其中TMF中的成纖維細(xì)胞相比標(biāo)準(zhǔn)墨水更好地在三維環(huán)境中展開，上皮細(xì)胞也形成了緊密的層狀結(jié)構(gòu)。研究人員還將MDA-MB-231癌細(xì)胞打印在具有不同粘彈性的凝膠內(nèi)進(jìn)行體外癌癥建模。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明癌細(xì)胞的增殖和遷移可通過粘彈性調(diào)控。該工作對使用多孔凝膠用于組織工程、癌癥模型等生物應(yīng)用提供新思路。
以上成果發(fā)表在RSC旗下Materials Horizons期刊?（Triggered micropore-forming bioprinting of porous viscoelastic hydrogels, Materials Horizons, 2020, 10.1039/D0MH00813C）。論文的第一作者為加拿大麥吉爾大學(xué)機(jī)械工程專業(yè)博士生鮑光宇。共同通訊作者為麥吉爾大學(xué)李劍宇教授和Luc?Mongeau教授，兩人皆為Canada Research Chair。
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