光療診斷學(xué)近年來(lái)引起了人們的極大興趣，因?yàn)樗试S在光照開始時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)診斷和同時(shí)進(jìn)行原位治療，從而為癌癥研究開辟了一條新的途徑。目前人們不斷探索各種診斷成像和治療模式，以構(gòu)建光療系統(tǒng)。在各種診斷技術(shù)中，熒光成像（FLI）具有靈敏度高、響應(yīng)快、無(wú)創(chuàng)性等顯著優(yōu)點(diǎn)，可在現(xiàn)場(chǎng)和時(shí)間上直觀顯示，但由于穿透深度不足，其在體內(nèi)的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。相比之下，光聲成像(PAI)作為另一種光觸發(fā)診斷方案，能夠提供具有非常高成像深度的圖像，并以微觀空間分辨率描繪深部腫瘤輪廓，但缺乏靈敏度。
FLI與PAI的整合將明確有助于通過(guò)協(xié)調(diào)成像靈敏度、空間分辨率和穿透深度來(lái)獲得豐富而精確的腫瘤信息。光療法包括光動(dòng)力療法（PDT）和光熱療法（PTT），是一種光可控、無(wú)創(chuàng)、有效的治療手段，PTT過(guò)程中產(chǎn)生的熱信號(hào)也可以通過(guò)光熱成像系統(tǒng)（PTI）捕獲，從而提供良好的溫度敏感性和實(shí)時(shí)監(jiān)控的可能性。但是，由于PDT腫瘤微環(huán)境的缺氧性和PTT的熱休克效應(yīng)，PDT或PTT單獨(dú)使用的效率通常是不令人滿意的。
PDT和PTT的合作被認(rèn)為是突破性的策略，可以克服各自的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，提高治療效果。例如，PTT可通過(guò)提高血流量改善腫瘤組織的供氧，從而促進(jìn)PDT效應(yīng)，從而進(jìn)一步消除PTT中的耐熱腫瘤細(xì)胞。因此，巧妙地構(gòu)建多功能光療系統(tǒng)，允許同時(shí)進(jìn)行多模式成像和協(xié)同光療將是至關(guān)重要的。
最近，唐本忠院士和深圳大學(xué)王東副教授在《Advanced Materials》發(fā)表了題為“An All‐Round Athlete on the Track of Phototheranostics: Subtly Regulating the Balance between Radiative and Nonradiative Decays for Multimodal Imaging‐Guided Synergistic Therapy”的通訊，報(bào)道了了一種簡(jiǎn)單而強(qiáng)大的基于聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)活性熒光團(tuán)的光療法。由于其強(qiáng)大的電子供體-受體相互作用和精細(xì)調(diào)制分子內(nèi)運(yùn)動(dòng), 基于AIE熒光團(tuán)的納米顆粒同時(shí)顯示出明亮的近紅外II（NIR–II）熒光發(fā)射、有效的活性氧生成以及在近紅外輻射下的高光熱轉(zhuǎn)換效率，表明輻射和非輻射能量耗散之間實(shí)現(xiàn)了平衡。
此外，NIR-II FLI-PAI-PTI三模成像引導(dǎo)下PDT-PTT協(xié)同治療的空前表現(xiàn)被精確的腫瘤診斷和完全的腫瘤清除結(jié)果所證明。因此，這項(xiàng)研究帶來(lái)了一個(gè)新的見解，以發(fā)展優(yōu)越的多功能光療法用于癌癥治療。
1.?分子設(shè)計(jì)與性能
通常由于電子帶隙的減小和系間竄越（ISC）過(guò)程的加強(qiáng)，電子供體-受體（D–A）相互作用整合到共軛結(jié)構(gòu)生色團(tuán)中可以顯著促進(jìn)紅移吸收/發(fā)射和ROS生成。
在因此，他們?cè)O(shè)計(jì)了化合物TI、TSI和TSSI，由1,3-雙（雙氰甲基）吲哚部分（作為受體）、三苯胺（TPA）單元（供體D）和/或噻吩段（D和π橋）組成，顯示出極強(qiáng)的D-A相互作用和不同程度的π-共軛。選擇TPA部分是因?yàn)樗粌H可以作為強(qiáng)電子供體，而且可以作為分子轉(zhuǎn)子。
此外，TPA段高度扭曲的構(gòu)象會(huì)延長(zhǎng)分子間的距離，即使在聚集態(tài)也會(huì)導(dǎo)致相對(duì)松散的分子間堆積，這有助于保留部分分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，從而有利于納米粒子內(nèi)部的發(fā)熱。此外，這些化合物的螺旋槳狀扭曲結(jié)構(gòu)還可以通過(guò)顯著減少分子間π–π堆積而有效地抑制粒子內(nèi)聚集體中的熒光猝滅。
另一方面，與分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)相比，作為另一種高頻分子運(yùn)動(dòng)的分子內(nèi)伸縮振動(dòng)對(duì)外界環(huán)境約束的敏感性較低，對(duì)提高產(chǎn)熱極為有利。因此選擇了兩個(gè)丙二腈改性二氫化茚作為電子受體，不僅因?yàn)樗碾娮訕O度缺乏，而且主要考慮到結(jié)構(gòu)中碳氮鍵的劇烈拉伸振動(dòng)，并且這無(wú)疑有利于聚集態(tài)分子內(nèi)的運(yùn)動(dòng)，很有希望作為分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)的有力補(bǔ)充，以保證納米粒子內(nèi)PTT-PTI-PAI的良好效率。此外，TSI和TSSI的共軛主鏈中的噻吩段被設(shè)計(jì)成進(jìn)一步增強(qiáng)供電子的性質(zhì)，從而顯著地使吸收/發(fā)射波長(zhǎng)紅移。
此外，在TI、TSI和TSSI中逐漸增強(qiáng)的D–A強(qiáng)度也可以顯著提高具有細(xì)胞毒性的ROS的產(chǎn)生能力，從而提高PDT的效率。同時(shí)，噻吩環(huán)的引入也有望擴(kuò)大TPA單元與大分子電子受體之間的分子內(nèi)距離，進(jìn)一步提高聚集態(tài)分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)和光熱轉(zhuǎn)化效率。因此，具有最大D–A強(qiáng)度和聚集態(tài)分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)的TSSI化合物將是構(gòu)建具有NIR–II發(fā)射的多功能光療法的最有希望的候選材料。
圖1 分子結(jié)構(gòu)、納米制造和多功能光療應(yīng)用的示意圖。A）化合物的分子結(jié)構(gòu)，包括TI，TSI和TSSI。B） 納米沉淀法制備TSSI納米粒子。C） 說(shuō)明協(xié)調(diào)的光物理過(guò)程和TSSI NP在NIR-II FLI-PAI-PTI三模成像引導(dǎo)下的PDT-PTT協(xié)同癌癥治療中的應(yīng)用。
TI、TSI和TSSI的光學(xué)性質(zhì)。得益于從TI到TSSI的D–A強(qiáng)度的有序增強(qiáng)，這些化合物在固態(tài)中逐漸顯示出620至664 nm的深紅色最大吸收峰。這三種化合物在純CHCl3溶液中都有微弱的發(fā)射，發(fā)射強(qiáng)度隨著混合溶劑中正己烷含量的增加而逐漸增大，表明了它們典型的AIE特性。研究了其在DMSO溶液中的光熱轉(zhuǎn)化行為，在660nm激光照射5min后，TI、TSI和TSSI的溫度迅速有效地升高，分別在47、54和61°C下達(dá)到穩(wěn)定，證明由于溶液中分子的振動(dòng)運(yùn)動(dòng)，激子能量主要通過(guò)熱失活途徑耗散。
圖2 TI，TSI，TSSI和相應(yīng)納米粒子的光物理、光動(dòng)力和光熱特性。A） 固態(tài)歸一化吸收光譜。B） 相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度（I/I?0）與己烷分?jǐn)?shù)的關(guān)系圖。I?0和I分別是CHCl3和CHCl3/正己烷混合物中熒光強(qiáng)度的峰值。C） 660nm激光輻照下AIEgens（100×10?6M）在DMSO溶液中的光熱轉(zhuǎn)化行為比較。D）?納米粒子的尺寸分布和E）TEM圖像。F） 這些納米粒子在水溶液中的歸一化吸收光譜和G）歸一化發(fā)射光譜。H） 在660nm激光照射下，這些納米粒子（1×10?6M AIEgen）的ROS生成。I)比較這些納米粒子(100×10?6?M AIEgen)在660 nm激光照射下水溶液中的光熱轉(zhuǎn)換行為。
為了制備生物相容性和分散性良好的AIE納米粒子，疏水性TI、TSI和TSSI通過(guò)納米沉淀法直接用兩親性共聚物DSPE-mPEG2000封裝。納米粒子表現(xiàn)出廣泛而強(qiáng)烈的吸收，尤其是TSSI?納米粒子的吸收幾乎覆蓋了整個(gè)NIR-I范圍，尾部延伸至1000 nm。近紅外區(qū)的長(zhǎng)吸收波長(zhǎng)是光療診斷學(xué)在體內(nèi)應(yīng)用的重要前提之一，因?yàn)榕c紫外或可見光相比，它能深入組織，對(duì)組織造成的損傷更小。
研究了AIE納米粒子的ROS生成效率。在TSSI納米粒子存在下，經(jīng)5min激光照射后，指示劑DCFH的發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到250倍以上，TSSI納米粒子的ROS產(chǎn)生效率明顯優(yōu)于TI和TSI納米粒子，這可能是由于TSSI的D-A相互作用較強(qiáng)。評(píng)估了TI、TSI和TSSI 納米粒子的光熱效應(yīng)。它們的溶液溫度在近紅外激光照射100秒內(nèi)迅速升高，TSSI納米粒子的溫度升幅（ΔT≈28°C）高于TI納米粒子（ΔT≈18°C）和TSI納米粒子（ΔT≈24°C）。TSSI納米粒子的光熱轉(zhuǎn)換效率約為46.0%，高于之前報(bào)告的絕大多數(shù)光熱劑。
2.?光療應(yīng)用
TSSI納米粒子對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的體外協(xié)同光療效果。TSSI NP在孵育3小時(shí)內(nèi)大量?jī)?nèi)化到4T1細(xì)胞，并被捕獲到溶酶體中。研究了近紅外激光誘導(dǎo)的TSSI納米粒子對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。首先，在黑暗條件下，即使在高濃度下，TSSI NP也未發(fā)現(xiàn)對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞（LO2和NIH 3T3）的明顯毒性，表明其具有非凡的生物相容性。在NIR照射（660 nm，0.3 W cm?2，5 min）后，TSSI NP對(duì)4T1細(xì)胞具有超高的抑瘤效果，IC50（導(dǎo)致50%生長(zhǎng)抑制的濃度）值低至7.3μg mL?1。這是因?yàn)榛罴?xì)胞可以有效地產(chǎn)生ROS，有效促進(jìn)TSSI NP對(duì)4T1細(xì)胞的高光毒性。
圖3 TSSI-納米粒子對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞內(nèi)吞及協(xié)同抑瘤作用。A） 用TSSI NP（10μg mL?1?TSSI）孵育3 h后的4T1細(xì)胞的CLSM圖像。B）用TSSI NP和TSSI NP孵育24 h后的4T1細(xì)胞的細(xì)胞活力通過(guò)CCK‐8測(cè)定（平均值±SD，n=6）。C） 用PBS、PBS（+L，12h后）、TSSI NP和TSSI NP處理13 h（50μg mL?1?TSSI）的4T1細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)ROS水平（上排）和活/死細(xì)胞染色（下排）。
TSSI納米粒子的三模（NIR‐II FLI‐PAI‐PTI）成像能力。小鼠在給藥TSSI納米粒子（0小時(shí)）前用1020nm的長(zhǎng)程（LP）濾光片顯示出極微弱的自體熒光。在注射后6h，腫瘤區(qū)域出現(xiàn)強(qiáng)烈的NIR-II熒光信號(hào)，表明在EPR效應(yīng)的驅(qū)動(dòng)下，TSSI-NPs在腫瘤組織中顯著積聚。研究了體內(nèi)產(chǎn)生光聲（PA）信號(hào)的能力。注射前（0h）檢測(cè)到微弱的PA信號(hào)，隨著時(shí)間的推移，腫瘤部位的PA強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，在注射后12小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定。因此PAI可以作為NIR-II-FLI的有力補(bǔ)充成像方式。然后在靜脈注射TSSI納米粒子12 h后，用660nm激光對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)光熱實(shí)驗(yàn)，用紅外熱像儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)過(guò)程溫度。2分鐘內(nèi)近紅外輻射后腫瘤組織的溫度可以上升至50℃左右，這表明PTT應(yīng)用的巨大潛力。
圖4 通過(guò)全身給藥，體內(nèi)多模式成像引導(dǎo)TSSI納米粒子對(duì)4T1荷瘤BALB/c裸鼠的協(xié)同治療效果。A） 給藥TSSI NP后不同監(jiān)測(cè)時(shí)間腫瘤組織的NIR-II FL圖像（上排）和PA圖像（下排）。B） TSSI納米粒子注射后12小時(shí)連續(xù)近紅外輻射期間腫瘤小鼠的熱圖像、加熱溫度（在腫瘤部位）。C） 不同治療方法的荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線的時(shí)間依賴性（n=6，*p<0.001）。D） 不同治療后第15天采集的腫瘤照片。E） 腫瘤組織H&E、TUNEL、CD31染色分析及不同治療后肺組織H&E染色分析。TUNEL和CD31陽(yáng)性細(xì)胞分別被染成紅色和綠色。
評(píng)估TSSI納米粒子的體內(nèi)殺瘤活性。對(duì)4T1移植瘤BALB/c裸鼠全身給藥，在此期間只進(jìn)行一次注射，然后在注射后12小時(shí)僅進(jìn)行一次NIR照射。在治療后的第3天，幾乎所有用TSSI納米粒子加NIR照射的小鼠實(shí)體瘤都被消除了。隨后，通過(guò)組織學(xué)和免疫組化研究進(jìn)一步分析體內(nèi)治療機(jī)制。近紅外激光誘導(dǎo)的協(xié)同熱療和基于TSSI納米粒子的ROS可導(dǎo)致腫瘤組織廣泛破壞，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯異常，空洞多，核固縮明顯。
TSSI納米粒的潛在全身毒性。在治療過(guò)程中，每三天測(cè)量一次所有治療小鼠的體重，未發(fā)現(xiàn)各組的體重有明顯變化。15天后處死小鼠，采集血液進(jìn)行血液學(xué)和血液生化分析。與生理鹽水組相比，肝功能指標(biāo)和腎功能指標(biāo)的血液生化參數(shù)均較生理鹽水組高，TSSI 納米粒子給藥組的尿素氮（BUN）似乎正常，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TSSI?納米粒子沒(méi)有明顯的全身副作用。
圖5 TSSI納米粒子體內(nèi)生物安全性評(píng)價(jià)。A） 不同處理組小鼠超過(guò)15d體重變化，C）給藥后15天小鼠血液生化指標(biāo)，包括肝功能指標(biāo)（B）和腎功能指標(biāo)（C）。D） 不同處理15d后主要器官的H&E染色切片圖像。
亮點(diǎn)小結(jié)
綜上所述，作者報(bào)告了一種基于單一AIE熒光團(tuán)的全方位光療劑，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)FLI、PAI、PTI、PDT和PTT。得益于AIE分子豐富的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)體和振子、扭曲構(gòu)象和高D-A強(qiáng)度，基于AIE分子的納米粒子可巧妙地實(shí)現(xiàn)輻射和非輻射激發(fā)態(tài)能量耗散之間的平衡，在單次660nm激光照射下表現(xiàn)出顯著的NIR-II熒光信號(hào)、極高的ROS產(chǎn)生和46%的光熱轉(zhuǎn)換效率。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，具有良好生物相容性的AIE 納米粒子在NIR‐II FLI‐PAI‐PTI三模成像引導(dǎo)下的PDT–PTT協(xié)同治療中表現(xiàn)良好，只需一次注射和一次照射即可同時(shí)精確地成像腫瘤并完全消除腫瘤。與傳統(tǒng)的all-in-one策略相比，基于AIEgen的one-for-all策略在實(shí)現(xiàn)多模式功能和最大化光療效果方面更為直接。
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